如何使用高效液相色谱（HPLC）检测维生素ADE？

前言

维生素A、D、E是维持人体和动物正常代谢功能所必需的脂溶性维生素，但人体和动物体无法自身合成，必须依靠食物来源提供足够的维生素。保健食品、特殊医学用途配方食品和婴幼儿配方食品是补充维生素的重要途径。准确测定食品中维生素的含量，对于科学指导膳食和保障食品安全具有重要意义。

目前，食品中维生素A和E的测定参照《GB 5009.82-2016 食品安全国家标准 食品中维生素A、D、E的测定（部分有效）》，维生素D的测定参照《GB 5009.296-2023 食品安全国家标准 食品中维生素D的测定》。GB 5009.296-2023将于2024年3月6日正式实施，新标准主要增加了在线柱切换反相液相色谱法作为第二法。本方案参照该标准第二法，采用BIKAI的二维液相色谱系统，实现VA和VE（含四种异构体）的一维分析，并将一维上的VD中心馏分切割至二维色谱柱，以消除样品中的基质干扰，实现低含量VD的定量检测。

1. 实验条件

1.1 系统构成及阀切换过程

仪器系统：BIKAI 1511 Pro 二维液相色谱系统
系统配置：P60 双三元梯度泵
A50C 自动进样器
C10V2 柱温箱（内置2个两位六通阀）
D10 紫外检测器

本方案采用两块六通阀，交替使用紫外检测器进行一维和二维检测，在一张色谱图上显示二维分离效果。通过阀切换，将一维色谱柱上的VD切割至捕集柱柱头，再经二维泵反向洗脱至二维反相色谱柱，实现VD的净化与分离。具体流路连接方式及实验步骤如下所示。

1.2 方法条件

2. 实验结果与讨论

2.1 捕集柱保留效果考察

由于中心切割时一维流动相中甲醇比例较高，存在目标物在捕集柱上“流穿”的风险，因此本实验考察了切割过程中捕集柱对VD的保留效果。具体操作如下：13.9分钟后保持阀位不变（左阀和右阀均为1-2），在右阀3号口外接另一台紫外检测器，进VD2/VD3混合标准溶液，谱图如下图所示。由结果可知，两台检测器之间的出峰间隔时间为2.5分钟。因此，在1分钟的切割窗口（13.9-14.9分钟）内，VD仍保留在捕集柱上，中心切割效果较好。

2.2 色谱分离效果

按照上述方法对混合标准溶液进行分析，所得色谱图如下图所示。结果表明，VA、VD2、VD3、α-VE、β-VE、γ-VE、δ-VE分离良好。一维色谱中β-VE与γ-VE的分离度为1.66，VD2与VD3的分离度为2.75，满足方法的定量要求。基于本方案的阀路配置，一维中VD的可视峰信号可辅助判断一维保留时间漂移对中心切割窗口的影响，使本方法在实际样品分析中更具适用性。

2.3 方法学考察

2.3.1 线性范围、灵敏度、重复性

以甲醇配制ADE混合标准工作溶液（VA：100 μg/mL；α、β、γ、δ-VE：1000 μg/mL；VD2、VD3：1 μg/mL），再逐级稀释得到一系列标准溶液。由于配方食品中VD添加量较低，而VA和VE含量较高且固定，本研究考察了VA在0.1-10 μg/mL浓度范围内、VE在1-100 μg/mL浓度范围内、VD在1-100 ng/mL浓度范围内的线性关系，并重点考察了VD的仪器检出限。由结果可知，在进样量为100 μL条件下，各化合物线性关系良好，相关系数>0.9999；当VD2和VD3浓度为1 ng/mL时，信噪比S/N>3，以样品量5 g、定容体积10 mL计，估算本方法检出限为0.2 μg/100g，低于GB 5009.296-2023中方法的检出限（0.6 μg/100g）。

选取ADE混合标准溶液（VA：1 μg/mL；α、β、γ、δ-VE：10 μg/mL；VD2、VD3：10 ng/mL），重复进样六针（重叠谱图如下所示），考察各化合物峰面积及保留时间的重复性。由结果可知，各化合物保留时间RSD小于0.1%，峰面积RSD小于1%，表明本方法稳定性良好。

2.3.2 样品测试

准确称取某品牌婴幼儿配方奶粉5g，按照GB 5009.82-2016第一法进行样品制备，进样分析，样品谱图如下所示。由结果可知，本方案可实现一次前处理、一次进样同时检测维生素ADE。通过反相二维液相色谱中心切割对VD进行净化分离，减少了基质干扰，可对奶粉中低含量VD进行准确定量。

3. 结论

本方案采用BIKAI 1511 Pro二维液相色谱系统，建立了食品中维生素ADE含量的分析方法。本方法采用反相二维液相色谱中心切割，避免了VD正相净化的繁琐步骤，一次前处理后一针进样即可实现维生素ADE的同时检测；采用BIKAI P60双三元梯度泵搭配单检测器的方案，使仪器配置更加精简，项目运行成本更低。经过初步方法学考察，本方案的线性范围、重复性及灵敏度均满足国家标准要求，结果准确可靠，可作为食品基质中脂溶性维生素快速分析的有效手段。